Praca do wglądu w Bibliotece Wydziału Chemii.

Krótkie streszczenie pracy:
Produkty Amadriego, w tym glikokoniugaty, są potencjalnie użytecznymi markerami procesów chorobowych, m.in. cukrzycy, choroby Alzheimera czy procesu starzenia. Podstawowym celem pracy doktorskiej było opracowanie wydajnej metody syntezy glikokoniugatów na nośniku stałym. W ramach realizacji tego założenia zaprojektowano i zsyntezowano nowy reagent N^α-9-fluorenylometoksykarbonylo-N^ε-tert-butyloksykarbonylo-N^ε-(2,3:4,5-di-O-izopropylideno-1-deoksy-β-D-fruktopiranoz-1-ylo)lizynę, który wykorzystano w syntezie peptydowych produktów Amadoriego na nośniku stałym. Wykorzystując nową pochodną lizyny zsyntezowano na nośniku stałym modelowy glikowany tetrapeptyd oraz dziewięć glikowanych analogów dwóch fragmentówalbuminy surowicy wołowej [291-300] oraz [550-560]. Umożliwiłoto przetestowanie możliwości selektywnego wprowadzenia N^α-9 fluorenylometoksykarbonylo-N^ε-tert-butyloksykarbonylo-N^ε-(2,3:4,5-di-O-izopropylideno-1-deoksy-β-D-fruktopiranoz-1-ylo)lizyny do różnych miejsc łańcucha peptydowego.
Synteza glikokoniugatów z wykorzystaniem Fmoc-Lys(i,i-Fru,Boc)-OH na nośniku stałym jest kompatybilna z klasyczną strategią Fmoc. Struktury otrzymanych izomerycznych glikokoniugatów potwierdzono za pomocą spektrometrii mas stosując dwie metody fragmentacji: indukowanej wychwytem elektronu (ECD) oraz indukowanej kolizyjnie (CID). Zastosowanie fragmentacji ECD pozwoliło jednoznacznie zlokalizować miejsce modyfikacji i ułatwiło interpretację widm fragmentacyjnych. Dodatkowo, wykorzystując metodę fragmentacji ECD, zastosowano technikę typu „bottom up” do potwierdzenia struktury izomerycznych peptydowych produktów Amadoriego powstałych w wyniku trawienia enzymatycznego glikowanej termicznie ubikwityny, oraz technikę „top down” do lokalizacji miejsc modyfikacji w niehomogenicznie glikowanej ubikwitynie przy użyciu wysokorozdzielczej spektometrii mas FT-ICR.
Opracowano trzy różne metody selektywnej detekcji glikokoniugatów w hydrolizatach białkowych za pomocą spektrometrii mas. W pierwszej metodzie wykorzystano charakterystyczne straty neutralne powstające w trakcie fragmentacji MS/MS do poszukiwania glikokoniugatów w mieszaninie. W drugim podejściu wykorzystano powszechnie znaną zdolność buforu boranowego do tworzenia stabilnych kompleksów z cis-diolami. Pozwoliło to na opracowanie nowej metody detekcji glikowanych peptydów. W trzeciej metodzie zastosowano znakowanie izotopowe (¹³C, ¹⁸O) w cząsteczce cukru modyfikowanego białka w połączeniu z hydrolizą enzymatyczną i metod MS lub LC-MS do szybkiego i jednoznacznego wskazywania glikokoniugatów w złożonych mieszaninach peptydów znajdujących się w hydrolizatach białkowych.
Ponadto wykazano wpływ stopnia glikacji białek na stabilność struktury trzeciorzędowej pod zwiększonym ciśnieniem.